im Fortgeschrittenen-Praktikum Biochemie (Universität Köln)

In diesem Praktikumsversuch werden Methoden vorgestellt, die in der Laborpraxis sowohl zum direkten Nachweis der Proteinproduktion in heterologen Expressionssystemen als auch zur Bestimmung der Molmasse eines Proteins eingesetzt werden.

Für die Untersuchungen wird eine Untereinheit eines zyklisch Nukleotid-gesteuerten Ionenkanals (CNG-Kanal) verwendet, der u.a. in den Photorezeptorzellen von Säugetieren exprimiert wird. Diese Ionenkanäle sind an Signaltransduktionsketten in verschiedenen Zelltypen beteiligt.

Licht stimuliert in den Außensegmenten von Sehzellen über eine Enzymkaskade die Hydrolyse das sekundären Botenstoffs cGMP. Infolge der sinkenden cGMP-Konzentration schließen die CNG-Kanäle in der Plasmamembran. Der sog. Dunkelstrom der Sehzelle wird reduziert und die Zelle hyperpolarisiert. Dieses elektrische Signal läuft dann passiv über das Innensegment und das Axon bis zur präsynaptischen Endigung der Sehzelle weiter, wo es zu einer Verringerung der Transmitter-Freisetzung kommt. CNG-Kanäle spielen jedoch nicht nur bei der Erregung der Sehzelle, sondern auch bei der Wiederherstellung des Dunkelzustandes eine wichtige Rolle. Durch die geöffneten Kanäle fließen neben Na⁺ auch Ca²⁺ Ionen. Schließen die Kanäle infolge der Belichtung der Sehzelle, sinkt die intrazelluläre Ca²⁺ Konzentration. Hierdurch wird eine Guanylyl Zyklase aktiviert, die neues cGMP synthetisiert. Infolge des Anstiegs der cGMP-Konzentration werden die CNG-Kanäle wieder geöffnet. Außer in Sehzellen existieren ähnliche Signaltransduktions-wege, an denen CNG-Kanäle beteiligt sind, auch in anderen sensorischen Zellen, z.B. in den "Riechzellen" des olfaktorischen Epithels.

Mittlerweile sind einige CNG-Kanäle aus Vertebraten und Invertebraten molekularbiologisch kloniert und durch elektrophysiologische und biochemische Untersuchungen strukturell und funktionell charakterisiert worden. Eine hilfreiche Methode ist dabei die Expression eines Kanals in einem heterologen Expressionssystem. Im ersten Teil des Praktikumsversuchs werden Säugetierzellen untersucht, in die die cDNA, die den Ionenkanal kodiert, transient transfiziert wurde. Im zweiten Teil des Versuchs wird eine Zelllinie verwendet, in deren Genom die Information für eine Untereinheit des Rinder-Sehzellenkanals eingebaut wurde. Diese Zelllinie exprimiert das Kanalprotein konstitutiv.

Nachweis des Ionenkanals in transient transfizierten Säugetierzellen

Methoden: Fixierung der Zellen mit Paraformaldehyd in Multiwell-Schalen;Inkubation mit spezifischen Antikörpern, die gegen das Kanalprotein gerichtet sind (Primärantikörper); Inkubation mit Sekundärantikörpern, die gegen den ersten Antikörper gerichtet sind und an die Meerrettich Peroxidase (HRP) gekoppelt ist; Nachweis der gebundenen Antikörper durch einen HRP-vermittelten Farbumsatz; Auszählen der gefärbten Zellen (Mikroskopie) und Bestimmung der Transfektionsrate.

Bestimmung der Molmasse einer Untereinheit des CNG-Kanals

Methoden: Aufschluß der Zellen; Isolierung der Membran- und Zytoplasmafraktion; Bestimmung der Proteinkonzentration; Auftrennung der Proteine in einem denaturierenden Polyacrylamid (PAA) Gel; Transfer der Proteine auf eine PVDF-Membran (Western-Blot); Nachweis der Kanal-Untereinheit mit spezifischen Antikörpern; Bestimmung der Molmasse der Untereinheit.